1.百螢---Annexin V簡(jiǎn)介

Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。

2.百螢---Annexin V適用儀器

Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒適用儀器：流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡

3.百螢---Annexin V常見問(wèn)題以及解答

Q:  什么是Annexin V/PI測(cè)定？

A:  Annexin V/PI測(cè)定用于通過(guò)annexin V標(biāo)記區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和通過(guò)丙碘胺（PI）標(biāo)記區(qū)分壞死/死亡細(xì)胞。在早期凋亡階段，細(xì)胞膜開始失去不對(duì)稱性，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸（PS）轉(zhuǎn)位到膜的外表面，在此處annexin V共軛物可以檢測(cè)到它。然而，在細(xì)胞膜破裂的情況下，例如壞死，annexin V共軛物可以進(jìn)入并結(jié)合內(nèi)層膜中的PS殘基，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此，建議使用不透過(guò)細(xì)胞膜的核染料（如PI）與annexin V共軛物一起使用。這使用戶可以區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（annexin V染色）、晚期凋亡細(xì)胞（annexin V和PI染色）和壞死細(xì)胞（僅PI染色）。

Q:  Annexin V是什么顏色的？

A:  就其本身而言，Annexin V 是無(wú)色的且難以檢測(cè)。 為了檢測(cè)Annexin V 與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合，Annexin V 通常與異硫氰酸熒光素 (FITC) 結(jié)合，FITC 是一種綠色熒光化合物，激發(fā)峰為 491 nm，發(fā)射峰為 516 nm。 用 FITC 或任何其他綠色熒光染料標(biāo)記Annexin V，例如 iFluor 488（Ex/Em = 491/516 nm）。

Q:  Annexin V和TUNEL有什么區(qū)別？    

A:  末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記 (TUNEL) 是一種染色方法，用于識(shí)別細(xì)胞內(nèi) DNA 片段化位點(diǎn)——晚期細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性特征。 它使用酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 將修飾的 dNTP（例如 dUTP）連接到片段化 DNA 鏈的 3'-羥基末端。 dNTPs 通常用熒光團(tuán)修飾以促進(jìn)量化和/或可視化。

Annexin V 染色通過(guò)結(jié)合由于細(xì)胞膜不對(duì)稱性喪失而暴露在細(xì)胞外的 PS 殘基來(lái)識(shí)別細(xì)胞凋亡的早期階段。 Annexin V 通常用 FITC 等熒光團(tuán)標(biāo)記，以促進(jìn)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。

Q:  Annexin V陽(yáng)性是什么意思？

A:  Annexin V陽(yáng)性結(jié)果表明細(xì)胞處于凋亡的早期狀態(tài)，該術(shù)語(yǔ)通常用于Annexin V/PI檢測(cè)，通過(guò)根據(jù)細(xì)胞群的健康狀況來(lái)區(qū)分細(xì)胞群。詳情如下：

1.Annexin V 陰性/PI陰性：說(shuō)明細(xì)胞很健康

2.Annexin V 陽(yáng)性/PI陽(yáng)性：說(shuō)明該細(xì)胞處于壞死或凋亡晚期。

Q:  什么是Annexin V的陽(yáng)性對(duì)照？

A:  Annexin V陽(yáng)性對(duì)照是使用已知的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞。 當(dāng)用Annexin V 偶聯(lián)物（例如膜聯(lián)蛋白 V-FITC）染色時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。 例如，細(xì)胞凋亡可通過(guò)在 55°C 下加熱細(xì)胞 20 分鐘或處理已知可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞試劑（如喜樹堿或星形孢菌素）來(lái)誘導(dǎo)。

Q:  什么是Annexin V結(jié)合緩沖液？

A:  在實(shí)驗(yàn)樣品中，Annexin V結(jié)合緩沖液能夠促進(jìn)Annexin V與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。這些結(jié)合緩沖液需要含有足夠高濃度的鈣，使Annexin V與PS結(jié)合，但不能高到與其他磷脂結(jié)合。Annexin V結(jié)合緩沖液也可用于洗滌樣品，使其不含過(guò)量的膜聯(lián)蛋白和其他化學(xué)殘留物質(zhì)，以確保檢測(cè)。染色前，應(yīng)將細(xì)胞重懸于濃度為1x10^6/ml的Annexin V結(jié)合緩沖液中。

Q:  Annexin V是怎樣工作的？

A:  Annexin V 通過(guò)結(jié)合暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 殘基來(lái)識(shí)別正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞。 在活的健康細(xì)胞中，PS 殘基位于質(zhì)膜的內(nèi)層，在那里它們無(wú)法與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 當(dāng)細(xì)胞啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞凋亡）時(shí)，它們的質(zhì)膜會(huì)失去不對(duì)稱性。 PS 殘基從膜的內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部小葉，在那里它們可以與膜聯(lián)蛋白 V 結(jié)合。 Annexin V 通常與熒光團(tuán)（如 FITC）結(jié)合，以促進(jìn)凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。

Q:  Annexin V染色后，能否進(jìn)行細(xì)胞固定

A:  可以，細(xì)胞可以在Annexin V染色后進(jìn)行固定操作。如果需要固定細(xì)胞，請(qǐng)滿足以下三個(gè)條件：1.使用不含酒精的醛類固定。2.請(qǐng)使用含有CaCl2的緩沖液。3.避免使用洗滌劑或表面活性劑。注意事項(xiàng)：在Annexin V染色前，千萬(wàn)不要固定細(xì)胞，固定細(xì)胞會(huì)殺死細(xì)胞，而Annexin V染色只能在活細(xì)胞或組織上進(jìn)行。

Q:  Annexin V能染色壞死細(xì)胞嗎？

A:  是的，Annexin V可以染色壞死細(xì)胞。壞死是指不正常的細(xì)胞死亡，可能由各種事件觸發(fā)，包括組織缺血和缺氧或細(xì)胞區(qū)域的急性損傷。壞死細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵特征是質(zhì)膜破裂。這個(gè)事件使得Annexin V可以進(jìn)入整個(gè)質(zhì)膜，包括PS殘基存在的內(nèi)葉片，導(dǎo)致假陽(yáng)性。因此，建議使用細(xì)胞不滲透染料（例如丙碘錠或7-AAD）與Annexin V結(jié)合物相結(jié)合，以消除假陽(yáng)性并區(qū)分凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞。圖中使用Annexin V將凋亡細(xì)胞染成綠色，使用7-AAD將壞死細(xì)胞染成紅色。

Q:  染色完不能及時(shí)上機(jī)，樣本能固定嗎？

A:  細(xì)胞染色完成后，禁止固定，應(yīng)盡快檢測(cè)，若無(wú)法立即檢測(cè)，可將樣本管放冰上，減少外界環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，Annexin V 結(jié)合不穩(wěn)定，請(qǐng)務(wù)必在標(biāo)記結(jié)束后半小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

Q:  如何統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)？

A:  Annexin V 凋亡實(shí)驗(yàn)在做凋亡統(tǒng)計(jì)時(shí)一般統(tǒng)計(jì)細(xì)胞早期凋亡率，也有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)總的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或壞死細(xì)胞之和）。

Q：血液樣本是否可以用于凋亡檢測(cè)？

A：如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴?PS，能與 Annexin-V 結(jié)合，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

Q：有沒(méi)有更好的辦法處理貼壁細(xì)胞，來(lái)做流式凋亡實(shí)驗(yàn)？

A：檢測(cè)貼壁細(xì)胞時(shí)，若消化時(shí)間不易控制，建議用 Accutase 細(xì)胞消化液，對(duì)細(xì)胞損傷小且不會(huì)改變細(xì)胞膜上 PS 的分布。

Q:  細(xì)胞凋亡早期，可以用Annexin V-FITC/PI雙染色法區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞嗎?

A:  在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標(biāo)記的Annexin-V作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡即可鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。

壞死的細(xì)胞PS同樣也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，Annexin-V也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS,所以Annexin-V無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，能夠與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，而且它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜。早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過(guò)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)的PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被相應(yīng)通道接收。所以Annexin V和PI同時(shí)使用，就可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

圖為Annexin-V/PI雙染色后流式檢測(cè)結(jié)果分析

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